Twoim problemem jest to, że powszechną NICOŚĆ mylisz z osobistą PUSTKĄ
Seminarium 7.
Elektroforeza białek
E
LEKTROFOREZA
●
ruch fazy rozproszonej względem fazy rozpraszającej
wywołany
przyłoŜoną
zewnętrznie róŜnicą potencjałów elektrycznych (metoda chromatograficzna)
●
technika
- analityczna (jakościowa i ilościowa)
- preparatywna (izolacja)
Fazą rozproszona są
cząsteczki naładowane, a
fazą rozpraszająca jest
roztwór lub nośnik.
Cząsteczki biologiczne: aminokwasy, peptydy, białka, nukleotydy i kwasy nukleinowe,
posiadają grupy ulegające jonizacji, nadające cząsteczce wypadkowy ładunek + (kationy) lub
wypadkowy ładunek – (aniony). W zaleŜności od znaku ładunku wypadkowego, cząsteczki
migrują do katody (kataforeza) lub anody (anaforeza). Elektroforeza prowadzona w roztworze
to elektroforeza swobodna. Elektroforeza prowadzona w nośniku to elektroforeza pasmowa
Jako nośnik stosuje się bibułę (wysokonapięciowa elektroforeza bibułowa) lub Ŝele (np.
krzemionkowy, dekstranowy, agarowy, skrobiowy, agarozowy, poliakrylamidowy)
I
STOTA
ELEKTROFOREZY
- w czasie wędrówki, cząsteczki podlegają rozdzieleniu na skutek róŜnicy szybkości
ich wędrowania
- szybkość migracji zaleŜy od:
właściwości cząsteczki
(rozmiar, kształt, wielkość
ładunku);
właściwości buforu
(siła jonowa, skład jonowy); wielkości przyłoŜonego
pola elektrycznego
;
innych czynników
(temperatury, dyfuzji, elektroosmozy)
Wła
ś
ciwo
ś
ci cz
ą
steczki białka
- Wypadkowy ładunek białka zaleŜy od jego składu aminokwasowego i pH buforu fazy
rozpraszającej
- Prędkość wędrówki białka zaleŜy od : siły elektrycznej cząsteczki (suma ładunków); siły
tarcia cząsteczki (wielkości i kształt)
- Prędkość wędrowania – odwrotnie proporcjonalna do kwadratu promienia cząsteczki. Białka
o wydłuŜonym kształcie wędrują wolniej, niŜ to wynika z ich ładunku elektrycznego
Właściwości buforu
Białka jako jony obojnacze przyjmują ładunek + lub – w zaleŜności od swojego pI i pH
środowiska. Białka o pI niŜszym niŜ pH środowiska są anionami i wędrują do anody. Białka o
pI wyŜszym niŜ pH środowiska są kationami i wędrują do katody. Większość białek ma pI w
zakresie pH 4 – 7, bufory stosowane mają pH w granicach 8 - 9 jednostek. Zatem większość
białek jest anionami i wędruje do anody.
Siła jonowa buforu
- pochodna stęŜenia i wartościowości jonów buforu.
Zwrost siły jonowej – zwiększenie ostrości rozdziału oraz zmniejszenie ruchliwości
cząsteczek w polu elektrycznym. Optymalna ruchliwość jonów w buforach o sile jonowej
0.05 – 0.2.
Pole elektryczne
- stosuje się prąd stały i napięcie w granicach 100 – 300 V.
Wzrost napięcia – wzrost szybkości wędrówki jonów oraz wydzielenie duŜej ilości ciepła
1
Zbyt niskie napięcie - zwiększenie czasu elektroforezy, zwiększenie dyfuzji (zły rozdział)
Elektroforeza w Ŝelu
śel stabilizuje środowisko, w którym zachodzi rozdział elektroforetyczny. Środowisko
Ŝelowe (porowate) ma większą zdolność rozdzielczą niŜ sam roztwór,
poniewaŜ
cząsteczki
rozdzielane są w wyniku róŜnic w ich ruchliwości oraz w wyniku „przesiewania
molekularnego” przez pory Ŝelu. Wędrujące białka tworzą strefy odpowiadające ich
ruchliwościom. Po wyłączeniu pola elektrycznego białka, pozostają w miejscu, do którego
dotarły.
ś
el poliakrylamidowy
• posiada wysoką zdolność rozdzielczą
• odporny na działanie czynników chemicznych
• przezroczysty, bezbarwny, spręŜysty
• zapewnia powtarzalność rozdziałów
• polimer akrylamidu i bisakrylamidu (czynnik sieciujący)
• polimeryzacja inicjowana APS i katalizowana przez TEMED
• szybkość polimeryzacji zaleŜy od stęŜenie monomerów, wolnych rodników i
temperatury
• szybkość polimeryzacji spada w pH poniŜej 6
• obecność tlenu uniemoŜliwia polimeryzację – odgazowanie
• wielkości charakteryzujące Ŝel:
➔
%T
(procent w/o obu monomerów)
➔
%C
(procent czynnika sieciującego w całości monomerów)
• wielkość porów Ŝelu uwarunkowana proporcjami monomerów (stęŜenie Ŝelu)
• róŜne stęŜenia procentowe do rozdziału cząsteczek o róŜnej wielkości – efekt sita
molekularnego
• stosuje się określone stęŜenie lub gradient stęŜenia. Gradient zapewnia ciągłe
zmniejszenie rozmiaru porów (od góry do dołu Ŝelu) co pozwala na otrzymanie
cienkich prąŜków.
E
LEKTROFOREZA
W
ELEKTROLITACH
ZBUFOROWANYCH
• podczas elektroforezy cząsteczki wody ulegają elektrolizie i powstają protony (jony H
+) na anodzie oraz jony hydroksylowe (OH–) na katodzie.
• jony H+ i OH– i wędrują do przeciwnie naładowanych elektrod pH Ŝelu zmienia się,
rozdzielane cząsteczki przyłączają przeciwnie naładowane jony i stają się obojętne -
nie migrują
• następuje zmiana pH na kaŜdej z elektrod w miarę jak przybywają jony H+ i OH–. Na
ujemnej katodzie pH spada, a na dodatnej anodzie pH rośnie
Stosując bufory, pH Ŝelu jest stabilne i rozdzielane cząsteczki nie tracą swojego ładunku
– podlegają działaniu pola elektrycznego.
Bufor elektrodowy
• dwa układy buforów:
➢
ciągły
- do naczyń i do Ŝelu bufor o takim samym pH
➢
nieciągły
(wielofazowy) – bufory do naczyń i do Ŝelu róŜne
Jony pochodzące z Ŝelu wędrują jako pierwsze, następnie porusza się próbka i na końcu jony
z buforu do naczyń elektrodowych.
2
7.5%
Elektroforeza w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) - Metoda Laemmli’ego
✔
do wyznaczania względnych mas cząsteczkowych
✔
nieciągły gradient stęŜenia Ŝelu
- Ŝel zagęszczający – 4.5%
- Ŝel rozdzielający – 8.0%
✔
nieciągły gradient buforów
- bufor do próbki – Tris-HCl, pH 6.8, SDS, EDTA, 2-merkaptoetanol, glicerol, błękit
bromofenolowy
- bufor do Ŝelu zagęszczającego - Tris-HCl, pH 6.8, SDS
- bufor do Ŝelu rozdzielającego - Tris-HCl, pH 8.8, SDS
- bufor elektrodowy – glicyna / Tris, pH 8.3, SDS
»
Po usunięciu SDS-u białka powracają do swej natywnej struktury
Siarczan dodecylu sodu (SDS)
detergent anionowy - ujemny ładunek w szerokim zakresie pH
ujemny ładunek SDS rozbija białka kompleksowe na podjednostki
łańcuch polipeptydowy białka wiąŜe SDS porcjonalnie do swej względnej masy
cząsteczkowej (1.4g SDS na 1g polipeptydu)
polipeptyd uzyskuje silny ładunek ujemny
polipeptydy przyjmują formę pręta opłaszczonego cząsteczkami SDS
polipeptydy wędrują do anody
ruchliwość zaleŜy tylko od względnej masy cząsteczkowej polipeptydów
2 – merkaptoetanol lub ditiotreitol (DTT)
- cysteina zawiera grupę tiolową (-SH) która spontanicznie tworzy mostki disiarczkowe
(-S-S-) z inną grupą tiolową. Wiązanie disiarczkowe jest wiązaniem kowalencyjnym i nie
jest rozrywane przez SDS
- 2-merkaptoetanol i DTT są silnymi reduktorami - rozrywają wiązania disiarczkowe.
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)
działa ochronnie (konserwant); chelatuje dwuwartościowe kationy, co redukuje
aktywność enzymów proteolitycznych, dla których jony wapnia i magnezu są
kofaktorami
Glicerol
- słuŜy do zagęszczania próbki, co zapobiega dyfuzji próbki w czasie nakładania do
studzienek
Błekit bromofenolowy
3
Elektroforeza natywna - Metoda Ornstein’a – Davis’a
✗
układ nieciągły, niedenaturujący
✗
ruchliwość białka zaleŜy od jego ładunku, wielkości i kształtu cząsteczki
✗
pH buforu zapewniające stabilność cząsteczki
✗
pH buforu róŜne od wartości pI cząsteczki
✗
siła jonowa buforu do próbki stanowi 1/2 - 1/5 siły jonowej buforu elektrodowego
✗
stosuje się Ŝel
- pomocny przy nakładaniu próbki (widać próbkę w czasie nakładania) i w śledzeniu
rozdziału elektroforetycznego (wędruje wraz z czołem elektroforezy)
H2NCH2COO
–
+ H
+
przesunięta jest w lewo. Zatem w Ŝelu zagęszczającym o pH 6.8 równowaga reakcji
dysocjacji glicyny przesunięta jest w stronę jonu obojnaczego (mała ruchliwość glicyny w
polu elektrycznym). Jon Cl – obecny w Ŝelach ma znacznie większą ruchliwość niŜ glicyna.
Polipeptydy, błękit bromofenolowy mają większą ruchliwość niŜ glicyna, ale mniejszą niŜ
jony Cl – . Niskie stęŜenie Ŝelu zagęszczającego nie stanowi przeszkody sterycznej dla białek.
Pod wpływem przyłoŜonego pola elektrycznego wszystkie jony zaczynają się poruszać w
kierunku anody, najszybciej jon Cl
–
i bardzo wolno glicyna. Tworzy się gradient stęŜenia
jonów i spadek przewodnictwa Ŝelu zagęszczającego. Powstaje gradient potencjału w Ŝelu i
wolniejsze jony są przyspieszane - próbka ulega zagęszczeniu do bardzo wąskiej strefy. Kiedy
czoło rozdziału osiąga Ŝel rozdzielający (pH 8.8) jony glicynianowe przybierają ładunek
ujemny i wyprzedzają białka. Większe stęŜenie procentowe Ŝelu rozdzielającego działa na
zasadzie sita molekularnego - białka wędrują zgodnie z masą cząsteczkową.
Etapy elektroforezy SDS-PAGE
1. NałoŜenie próbki do studzienki w Ŝel zagęszczającym
2. Podłączeniu pola elektrycznego
3. Rozdzielanie cząsteczek według wielkości względnych mas cząsteczkowych
4. Wyłączenie zasilania
5. Wyjęcie Ŝelu z kasety
6. Wybarwieniu Ŝelu
Barwienie
Ŝ
eli kumazyn
ą
• Czułość detekcji: 1– 0.5 µg białka
• Kumazyna (Coomassie Brilliant Blue R250) wiąŜe się niespecyficznie z białkami.
Wiązanie jest prawie stechiometryczne
• Metoda mniej czuła niŜ barwienie srebrem
• Szeroko stosowana ze względu na szybkość i łatwość barwienia. śel zanurza się w
roztworze barwnika (25% MeOH, 10% CH
3
COOH, 0.1% CBB). Barwnik
niezwiązany z białkiem usuwa się w etapie odbarwiania Ŝelu. Białka dają niebieskie
prąŜki na bezbarwnym tle.
• aby uniknąć pęknięcia Ŝelu w czasie suszenia, do ostatniego płukania dodać 1%
glicerol.
• Wybarwianiu peptydów (Mr <10 000), Ŝel najpierw utrwala się w roztworze
zawierającym glutaraldehyd, aby uniemoŜliwić dyfucję peptydów i ich wypłukowanie
w czasie dalszych etapów barwienia.
Barwienie
Ŝ
eli srebrem
- czułość metody: 1–5 ng białka
- czułość (poziom detekcji) zaleŜy od: jakości uŜywanych odczynników, czystości uŜywanych
naczyń, trzymania się przepisu barwienia
4
G
RANICA
śELI
I
BUFORÓW
Gradientowi skokowemu gęstości Ŝeli, pH i składu buforów towarzyszy zjawisko odmiennej
ruchliwości jonów chlorkowych i glicynianowych w Ŝelu zagęszczającym i rozdzielającym.
Glicyna w pH poniŜej 9 jest słabo zdysocjowana i równowaga reakcji dysocjacji:
+
H2NCH2COO
–
®
- barwienie polega na nasyceniu Ŝelu jonami srebra i wywołaniu obrazu przez działanie
formaldehydem, który redukuje jony srebra do srebra metalicznego dając nierozpuszczalny
brazowy precypitat.
Analiza Ŝeli
• jakościowa (wzór elektroforegramu, względne masy cząsteczkowe)
• ilościowa (natęŜenie barwy poszczególnych prąŜków - denzytometria)
5