Twoim problemem jest to, że powszechną NICOŚĆ mylisz z osobistą PUSTKĄ
Metody i techniki wykorzystywane w diagnostyce molekularnej
Głowne kierunki analizy DNA
Amplifikacja DNA Hybrydyzacja molekularna
Klonowanie -Southern blot
Klonowanie DNA w - northern blot
wektorach - DNA fingerprinting
Amplifikacja In vitro PCR - FISH(zastosowanie w cytogenetyce)
Analiza sekwencji DNA
Hybrydyzacja( renaturacja)- połączenie ze soba dzieki wiazaniom miedzy parami zasad, dwoch komplementarnych polinukleotydów.
- Tworzenie podwójnej helisy między komplementarnymi nićmi DNA lub RNA pochodzących z różnych źródeł.
- Oddziaływanie badanego fragmentu DNA i sondy molekularnej prowadzi do utworzenia hybrydy ( dupleksu) o dwuniciowej strukturze.
Metody Hybrydyzacji Molekularnej:
- Metodą Southerna
- DNA fingerprinting
- typu northern
- fluorescencyjna in situ (FISH).
Sondą molekularną mogą być:
- syntetyczne oligomery
- syntetyczne lub naturalne geny lub ich fragmenty
- c DNA
- fragmenty chromosomów
- całe genomy bakteryjne
- sonda molekularna musi być denaturowana (jednoniciowa)
- łączenie sondy molekularnej z docelowym fragmentem kwasu nukleinowego zachodzi zgodnie z komplementarnością zasad.
- sonda jest wyznakowana radioaktywnie lub nieradioaktywnie np. fluorescencyjnie.
Hybrydyzacja metodą Southerna (Southern blot hybridization)
-Stosowana najczęściej , dotyczy hybrydyzacji DNA-DNA.
-Ma na celu wyszukiwanie sekwencji DNA spośród mieszaniny fragmentów otrzymanych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi.
STOSUJĄC HYBRYDYZACJĘ TYPU Southern można wykryć:
- rearanżacje genowe np. delecje albo insercje, wieksze od 50- 100pz
- mutacje punktowe, które tworzą nowe lub zmieniają dotychczasowe miejsce restrykcyjne dla enzymu, stosowanego do trawienia DNA.
Hybrydyzacja typu northern (northern blot hybridization)
-Technika stosowana do wykrywania określonej cząsteczki RNA wśród wielu innych cząsteczek RNA
- Dotyczy hybrydyzacji RNA pacjenta z sondą molekularną.
-Stosowana w celu badania ekspresji genów – jeśli filtr hybrydyzuje się z wyznakowanym fragmentem genomu, wykrywa się RNA na skutek ekspresji genów mieszczących się w tym fragmencie.
Hybrydyzacja typu northern
- elektroforeza w żelu agarozowym preparatu RNA w warunkach denaturujących.
- dwa prązki – dwie największe cząsteczki rRna
- w większości komórek żadnego z mRNA nie ma tak wiele, by utworzył prążek widoczny po barwieniu bromkiem etydyny.
- kwas nukleinowy z żelu przenosi się na błonę nylonową i hybrydyzuje z wyznakowanym fragmentem DNA.
DNA fingerprint
- w metodzie tej wykorzystuje się obecność w genomie polimorficznych sekwencji powtorzonych VNTR zmienna liczba tandemowych powtórzeń. W wyniku hybrydyzacji VNTR z sondami molekularnymi rozpoznającymi jednocześnie kilkanaście loci , otrzymuje się dla każdego osobnika charakterystyczny obraz fragmentów DNA tzw. Fingerprint, odcisk genetyczny .
- Zastosowanie:
- ustalanie ojcostwa
- badania medyczno – sądowe.
Klonowanie DNA
- Klonowanie DNA w wektorach .
- Klonowanie DNA In vitro – PCR.
Klonowanie DNA w wektorach
- Wektory są podstawowym narzędziem klonowania DNA.
Wprowadzenie fragmentu DNA do komórki biorcy następuje za pośrednictwem wektora, do którego fragment ten został uprzednio włączony (rekombinacja molekularna).
_Klonowanie polega na namnożeniu fragmentu DNA w komórkach mikroorganizmów (głównie bakterii). Wektor jest zdolny do autonomicznej replikacji.
- Większość rutynowych manipulacji przeprowadzanych podczas klonowania genów wykorzystuje jako gospodarza Escherichia coli.
Etapy klonowania DNA w mikroorganizmach.
- Cięcie enzymem restrykcyjnym DNA.
-Łączenie fragmentów DNA z wektorem.
- Wprowadzenie wektorów do komórek.
- Powielanie DNA w komórkach.
Wektor jest zdolny do autonomicznej replikacji.
Wektorami najczęściej używanymi do klonowania DNA w komórkach prokariotycznych:
-Bakteriofagi (fagi) –FagM13 (1kpz);
- Plazmid (5 kpz) – pUC19 (2686 par zasad)
- Kosmid- jest plazmidem zmodyfikowanym przez dodanie do niego sekwencji cos z faga λ (10-40 kpz).
-Sztuczny chromosom bakteryjny BAC (bacterial artifical chromosome) (100-300 kpz)
Do klonowania fragmentów DNA w organizmach eukariotycznych (np. drożdżach, komórkach ssaków) stosowane są:
- Wektory pochodne wirusów – w przypadku komórek zwierzęcych są to pochodne wirusów SV40, Papilloma, krowianki, bakulowirusów, adenowirusów i retrowirusów (somatyczna terapia achorzeń)
- Wektory drożdżowe – zdolność do replikacji w komórkach drożdży i bakterii.
*- Sztuczny chromosom drożdżowy YACs (yeast artificial chromosomes) do 5 milionów pz.
Klonowanie fragmentów DNA organizmach eukariotycznych (komórkach ssaków) (badania w toku):
- Sztuczne chromosomy ludzkie HAC (human artifical chromosome)
- Uzyskany dotychczas sztuczny chromosom, nazwany mikrochromosomem, różni się znacznie od chromosomu funkcjonalnego. Jeżeli konstrukcja sztucznego chromosomu ludzkiego zakończy się powodzeniem , chromosomy te (HACs) będą mogły być użyteczne do badania ekspresji genów oraz jako wektory stosowane w terapii genowej (dostarczanie genów do komórek somatycznych In vivo).
Amplifikacja DNA za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy- PCR (polymerase Chain Reaction).
Reakcja łańcuchowa polimerazy PCR
- należy do najważniejszych metod biologii molekularnej stosowanej powszechnie
- jest podstawową techniką badawczą i diagnostyczną wykorzystującą zdolność DNA do replikacji
- metoda ta opracowana w 1987 r. w USA (Mullis i Faloona, 1987)
- Nagroda Nobla w dziedzinie chemii- Kary Mullis – 1993.
Reakcja łańcuchowa polimerazy – PCR (polymerase Chain Reaction).
-jest enzymatyczną metodą amplifikacji (powielania) określonych sekwencji DNA.
- jest katalizowana, podobnie jak to się dzieje w komórkach przez polimerazy DNA, zwane także replikazami.
- pozwala na namnożenie określonych odcinków DNA w dowolnych potrzebnych ilościach.
- umożliwia ona analizę DNA nawet w przypadku bardzo małej jego ilości – można amplifikować poszukiwane odcinki DNA, dysponując DNA wyizolowanym nawet z pojedynczych komórek.
Reakcja łańcuchowa polimerazy – PCR
-Kilkanaście lat temu – wszystkie procedury wykonywane były manualnie.
- obecnie – termocyklery
- metoda w zdecydowany sposób przyśpieszyla uzyskiwanie wyników w pracach nad poznaniem struktury i funkcji genów.
PCR :
- umożliwia specyficzną amplifikację In vitro wybranych odcinków DNA i RNA przepisanych na eDNA, dzięki wykorzystaniu dwóch starterów komplementarnych do sekwencji docelowej.
- niezbędna jest znajomość sekwencji nukleotydowych.
- czułość reakcji pozwala amplifikować DNA pojedynczych genów ponad milion razy mimo obecności innych sekwencji.
Metoda PCR stanowi odwzorowanie procesu replikacji DNA – dochodzi w niej do syntezy komplementarnych nici DNA, ograniczonych położeniem starterów.
Reakcja amplifikacji DNA składa się z powtarzających się cykli, a każdy z nich przebiega w 3 etapach:
1)Denaturacja dwuniciowego DNA (ang. denaturation)
2)Przyłączenie starterów do komplementarnych sekwencji na denaturowanej matrycy DNA.
3)Wydłużenie starterów (ang. elongation)
-Zwiększanie się liczby syntezowanych cząsteczek w postępie geometrycznym, w którym teoretycznie po każdym cyklu ich liczba ulega podwojeniu , jest analogicznie do procesu rozszczepienia uranu w bombie atomowej.
- Liczba kopii DNA po zakończeniu około 30 cykli przekracza miliard i można je uwidocznić na żelu agarozowym zwykłą metodą barwienia. Ilość taka (0,2- 2 μg) wystarcza do analiz metodą trawienia restrykcyjnego, klonowania czy też sekwencjonowania.
1. 21 = 2
2. 22 = 4
3. 23 = 8
20. 220 = 1. 048 576
30. 230 = 1. 073 741 824
Metody oparte o PCR są:
- szybkie
-oszczędne
- akceptowane
- powtarzalne
-swoiste
Metoda PCR- zastosowania:
- wykrywanie obecności w genomie określonych odcinków genów oraz identyfikacji nosiciela mutacji powodujących choroby genetyczne – diagnostyka.
- wykrywanie obecności w organizmie wirusowego lub pro wirusowego DNA.
- zwiększenia ilości wybranych odcinków DNA do późniejszego sekwencjonowania lub tworzenia biblioteki genów.
- namnożenia fragmentów DNA ze szczątków organizmów kopalnych lub ze śladowych ilości materiału biologicznego.
- wykorzystywany w wielu dziedzinach np. genetyka populacji.
STRATEGIA DIAGNOSTYKI GENETYCZNEJ
GEN NEZNANY GEN ZNANY
ANALIZA SPRZĘŻEŃ POSZUKIWANIE MUTACJI
Gen nieznany – ANALIZA SPRZĘŻEŃ
- Metoda stosowana w sytuacji kiedy nie znamy genu związanego z...